Los bambúes pertenecientes al género Guadua son reconocidos a nivel mundial por sus diversas aplicaciones en los ámbitos ecológico, social, económico, cultural y medicinal. Sin embargo, hasta la fecha aún se desconoce información sobre su composición química y actividad biológica. En este contexto, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar la composición química y actividad biológica de bambúes del género Guadua mediante un enfoque metabolómico, con cuatro objetivos principales: (1) evaluar las variaciones en la composición química bajo la influencia de un gradiente altitudinal y mapear la diversidad química mediante GNPS; (2) correlacionar la composición química y actividades biológicas para la identificación de compuestos bioactivos; (3) evaluar las alteraciones metabólicas en las células HCT-116 tras la exposición al extracto de G. incana; y (4) aislar algunos compuestos bioactivos a partir del extracto activo de G. incana, guiado por el enfoque metabolómico. Los resultados obtenidos resaltan que en el primer objetivo se destaca un aumento significativo en la composición de flavonoides a altitudes elevadas. También se demostró una gran riqueza en la diversidad química de estos bambúes. En el segundo objetivo, se identificó la presencia de 49 compuestos en las especies de Guadua, incluyendo flavonoides y derivados de ácidos cinámicos que mostraron una fuerte correlación con las actividades antiinflamatoria y antioxidante. Particularmente, se encontró que flavonas glucosiladas presentaron una correlación positiva con el potencial citotóxico. En el tercer objetivo, se encontraron una alteración de 99 metabolitos en las células HCT-116 cuando fueron tratadas con el extracto activo de G. incana, asociados principalmente con el metabolismo del glutatión. Finalmente, en el cuarto objetivo se aisló una flavona glucosilada correspondiente a isoschaftosido que mostró una potente actividad citotóxica y una mezcla de tres flavonas derivadas de apigenina. En conclusión, este estudio aportó importantes y robustos datos científicos al conocimiento de la composición química y del potencial antioxidante, antiinflamatorio y citotóxico de diversas especies del género Guadua que aún no habían sido estudiadas.