Introducción: Los tratamientos actuales contra el cáncer colorrectal son la radioterapia y la quimioterapia, sin embargo, presentan efectos secundarios debido a su poca especificidad. Por eso, se buscan nuevas alternativas terapéuticas para reemplazarlos, entre estas, surgen moléculas obtenidas de bacterias, como las parasporinas, más específicamente la parasporina PS2Aa1 (Mpp46Aa1). Este estudio tiene como finalidad determinar la actividad citotóxica de proteínas mutantes de PS2Aa1 obtenidas por aproximación dirigida al sitio en líneas celulares de cáncer colorrectal SW480 y SW620. Materiales y métodos: Las proteínas se obtuvieron por medio del Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad de Santander. Las parasporinas tipo PS2Aa1 fueron utilizadas contra las líneas celulares en los ensayos de citotoxicidad, índices de selectividad, y activación de caspasas 3/7. Resultados: La mutante N65 con las sustituciones K92R (dominio I), L175D (dominio II) y S218G (dominio III) y la mutante 3-35 con una sustitución en G257V (dominio I) presentaron un IC50 de 1.0-1.4 y 1.2-1.7 μg/mL comparadas con la PS2Aa1 con un IC50 1.75-2.12 y 1.75-2.12 μg/mL, mientras que la sustitución de G256A de la 0-15 obtuvo un desempeño similar a la PS2Aa1, frente a las líneas celulares cancerígenas SW480 y SW620. Discusión: Las sustituciones en PS2Aa1, produjeron cambios conformacionales que potenciaron o no la actividad citotóxica e inducción de caspasas 3/7 como se ha propuesto en la literatura. Conclusiones: Las modificaciones de la PS2Aa1 revelan la utilidad de la mutación por evolución dirigida en la creación de variantes que potencian la actividad citotóxica frente a líneas celulares de cáncer de colon, manteniendo o aumentando su selectividad frente a líneas celulares de cáncer de colon.