Introducción: Las parasporinas (PS) son proteínas sintetizadas por Bacillus thuringiensis que exhiben actividad citotóxica contra diversas líneas celulares humanas, mostrando una baja o nula citotoxicidad hacia células no tumorales, Sin embargo, se han observado diferencias significativas en los perfiles de citotoxicidad y niveles de actividad frente a diferentes tipos de células cancerosas. El objetivo es generar mutantes de PS2Aa1 (Mpp46Aa1) con actividad modificada para elucidar mejor su mecanismo de acción. Esto implica recopilar información crucial para guiar la mutagénesis dirigida al sitio específico, asegurando la obtención de mutantes mejorados. Se llevará a cabo una evaluación de nuevas parasporinas obtenidas mediante evolución dirigida en células de leucemia MOLT 4 y JURKAT. Materiales y Métodos: Para el desarrollo de este artículo, se realizaron varias fases: primero, se hizo cultivo de Cepa BMB171 de Bacillus thuringiensis obtenida en el laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander; segundo, se aplicaron cultivos celulares a partir de la línea celular MOLT-4 Y JURKAT manteniéndose en un medio Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mientras que la línea celular CHO-K1 (células de ovario de hámster chino), se mantuvo en un medio DMEM 10%; luego se determinó la concentración celular mediante una dilución 1:2, con 30 μL del cultivo celular (MOLT-4 O JURKAT) y 30 μL de azul de tripano de invitrogen TM, posteriormente, se cuantificó la actividad metabólica a traves de Alarmar blue, la detección de Caspasas 3, 7; finalmente se realizó un análisis estadístico. Resultados: La mutante N65, con las sustituciones K92R (dominio I), L175D (dominio II) y S218G (dominio III), y la mutante 3-35, con la sustitución G257V (dominio I), mostraron valores de IC50 de 0.16-1.33 y 0.54-0.88 μg/mL respectivamente, en comparación con la PS2Aa1, que presentó IC50 de 0.013-1.86 y 0.26-1.24 μg/mL. La mutante 0-15, con la sustitución G256A, mostró un rendimiento similar a la PS2Aa1 frente a las líneas celulares cancerosas MOLT-4 y JURKAT. Discusión: Las sustituciones en PS2Aa1 generaron modificaciones en su conformación que pueden haber aumentado o no su actividad citotóxica y su capacidad para inducir caspasas 3/7, según se ha sugerido en estudios previos. Conclusiones: la mejora genética de proteínas es una herramienta desplegada para ampliar la funcionalidad de biomoléculas naturales para su uso como bioterapéuticos y biocatalizadores; este trabajo, encuentra que las proteínas modificadas genéticamente se han convertido en la clave para dilucidar la relación estructura-función de cualquier proteína. Las alteraciones en PS2Aa1 destacan la eficacia de la mutagénesis dirigida para desarrollar variantes que intensifican la actividad citotóxica contra células de leucemia, manteniendo o incluso mejorando su selectividad hacia estas líneas celulares específicas.