RESUMEN: En los últimos años, el lactosuero ha despertado un gran interés como subproducto agroindustrial en los procesos de fermentación microbiana. Debido a su bajo costo y su alta concentración de nutrientes, especialmente la lactosa como fuente principal de carbono, se ha convertido en un objeto de investigación para obtener diversos bio-productos. Sin embargo, el conocimiento sobre el efecto de la lactosa en el metabolismo bacteriano y su capacidad para producir metabolitos esenciales, como los aminoácidos, específicamente la L-valina, es limitado. Por lo tanto, se requieren estudios que utilicen enfoques de ingeniería metabólica de sistemas para comprender mejor el metabolismo de la lactosa y contribuir a la mejora de la producción. En este contexto, se realizó un estudio para evaluar el impacto de diferentes fuentes de carbono (glucosa, lactosa y lactosuero) en la producción de L-valina utilizando Escherichia coli mediante enfoques de ingeniería metabólica y genética. Para ello, se emplearon metodologías de ajuste de modelos de cinéticas de fermentación con las diferentes fuentes de carbono, lo que permitió identificar parámetros cinéticos relevantes. Además, se realizaron análisis de flujo metabólico, variabilidad de flujos, robustez y muestreo de Monte Carlo para comprender en detalle cómo las diferentes fuentes de carbono afectan el metabolismo de E. coli. Basándose en los resultados obtenidos in silico, se diseñó una plataforma que combinó estrategias de deleción y sobreexpresión génica mediante biología sintética de vanguardia con el objetivo de maximizar la producción de 2-cetoisovalerato (2-KIV), precursor clave en la producción de L-valina. Los resultados demostraron que el lactosuero beneficia la biosíntesis de L-valina (36% superior) con respecto a la glucosa y lactosa puras. Posteriormente se aplicaron conceptos de ingeniería metabólica como son el análisis de balance de flujos con los sustratos puros (glucosa y lactosa), donde se evidenció que la lactosa desencadena un mejor flujo de carbono por simultaneo consumo de glucosa y galactosa al hidrolizarse en el citoplasma, proporcionando máxima velocidad específica de crecimiento (0.82 h-1), unas producciones de moles de ATP, NADH, y NADHP por mol de lactosa de 55.3, 22.1 y 20.7, respectivamente. En efecto, gracias a los resultados in silico, se construyó una plataforma de E. coli W, donde primero fueron delecionados los genes mdh y aceF y posteriormente se sobreexpresaron los genes alsS, ilvC e ilvD para confirmar los supuestos generados en los análisis de flujo metabólico y lograr obtener titulaciones de 3.22 g 2-KIV/L y 1.39 g L-valina/L al emplear lactosuero como fuente de carbono, con el más alto rendimiento encontrado por sutrato en la producción de 2-KIV (0.81 g/g sustrato), destacando en rendimientos previamente reportados en la literatura y superando los desafíos asociados con la inhibición por producto y transporte en la producción de L-valina por fermentación. En resumen, este estudio destaca el potencial del lactosuero como materia prima altamente beneficiosa en medios de cultivo para la producción de L-valina y otros bioproductos. La aplicación de enfoques de ingeniería metabólica y genética no solo ha profundizado nuestra comprensión del metabolismo de la lactosa, sino que también ha permitido la creación de cepas mejoradas de E. coli W.