Los transposones son secuencias de ADN que pueden ser empleadas como herramientas en biología molecular y biotecnología. Por ejemplo, pueden ser empleados como una alternativa que permite mejorar la expresión heteróloga de genes presentes en ADN episomal que no son reconocidos por los hospederos bacterianos generalmente empleados. En el presente trabajo, se describe el desarrollo de “Mu_TnX”, un transposón de tipo Mu que puede ser empleado en estudios de análisis funcional de genes en diferentes hospederos bacterianos. Mediante herramientas computacionales, se realizó el diseño de la secuencia del transposón y se definió la estrategia para su ensamblaje. Utilizando metodologías de síntesis de ADN, PCR y clonación tradicional, se llevó a cabo la construcción de este. Se validó el funcionamiento de esta herramienta mediante la evaluación de su capacidad de transposición in vitro sobre un control de actividad empleando cepas de Escherichia coli y Pseudomonas putida. La capacidad de transposición in vitro fue comprobada al recuperar clones en las cepas evaluadas que exhibieron resistencia a los antibióticos empleados como marcadores de selección y la capacidad de inducir la expresión de genes se evidenció en clones que expresaron la proteína verde fluorescente bajo inducción del compuesto 3-metil benzoato. Aunque no se logró comprobar la misma capacidad en ADN metagenómico, Mu_TnX es la primera herramienta genética de este tipo capaz de funcionar en hospederos de diferentes especies, y se espera que su desarrollo aporte a los estudios de metagenómica funcional para el descubrimiento de genes y compuestos novedosos.