El objetivo general de este proyecto fue la produccion de plantas transformadas geneticamente de S. phureja variedad Yema de Huevo Clon 1 que sean potencialmente tolerantes a insectos, rasgo conferido por la insercion en su genoma del gen mirl2 derivado del pomelo (Citrus paradisi) que codifica para un inhibidor de proteasas de tipo Serina. Se trabajo con el sistema de transformacion mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando la cepa LBA4404 que contiene el plasmido residente pAL4404 y el vector binario pNOV022 el cual contiene el gen de interes mirl2. Se utilizaron como explantes entrenudos con una longitud de 0,5 a 1 cm provenientes de material in vitro entre cuatro a cinco semanas de edad, los cuales fueron co-cultivados en una concentracion bacteriana de 1/50, para posteriormente ser colocados en medio de regeneracion sin agente de seleccion. Se encontro que el medio de regeneracion mas apropiado esta compuesto por Zeatina Ribosido (ZR 2 mg/L), acido naftalenacetico (ANA 0,04 mg/L) y acido giberelico (AG3 0,1 mg/L) en el cual se logro obtener un 87,6% de callogenesis y un 48,6% de regeneracion. Posteriormente se establecio una poblacion de individuos potencialmente transgenicos, a partir de los cuales se realizo una extraccion de DNA, organizando los extractos en pools de diez individuos, obteniendose un total de 52 pools, a partir de 520 individuos. Se utilizaron cuatro diferentes cantidades de DNA para un volumen final de 50 μl en la PCR: 150 ng; 300 ng; 600 ng; 1.200 ng y se realizo PCR para los dos genes mirl2 (IP) y manA (PMI). Tras el analisis por electroforesis de los resultados de la PCR para cada uno de los pools no se observo la senal de amplificacion especifica de los genes de interes, en tanto que se observo la senal para los genes endogenos de control. Finalmente se analizaron 62 clones provenientes de un segundo ensayo de transformacion, los cuales fueron analizados individualmente. Se trabajo con una cantidad de DNA de 600 ng y se realizo PCR para los dos genes mirl2 (IP) y manA (PMI), siguiendo las mismas condiciones de trabajo. En esta segunda poblacion de regenerantes no se observo la amplificacion especifica para los genes de interes, sin embargo se observo la senal para los genes endogenos de control.
Tópico:
Plant tissue culture and regeneration
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FuenteDOAJ (DOAJ: Directory of Open Access Journals)