RBDV se transmite en asociacion con polen y por lo tanto la resistencia genetica de algunos cultivares del genero Rubus ha sido la unica medida de control efectivo. Sin embargo, recientemente aparecio la cepa viral R-15 de RBDV, la cual rompio la resistencia natural existente en algunos cultivares comerciales de frambuesa. El principal objetivo de este proyecto fue medir la resistencia transgenica a la infeccion con RBDV, la cual podria conferirse mediante diferentes secuencias de genes pertenecientes a este virus, adicionalmente, otro objetivo fue entender los mecanismos moleculares de resistencia transgenica que podrian ser generados por estos genes. Para medir la resistencia transgenica a RBDV, se introdujeron siete construcciones conteniendo secuencias genicas de RBDV dentro de Agrobacterium tumefaciens mediante conjugacion de la bacteria («triparental mating») y los cultivos resultantes se usaron para transformar fragmentos de hojas de Nicotiana tabacum o fragmentos de tallo de plantas de Nicotiana benthamiana provenientes de invernadero o de cultivo de tejido. Se utilizaron plantas regeneradas a partir de cultivo de tejido en medio que contenia kanamicina para obtener semillas que dieron origen a plantas de la generacion F1, las cuales se evaluaron para medir su resistencia a RBDV mediante la inoculacion manual de hojas jovenes y se analizaron para determinar el titulo de virus mediante ELISA despues de 5 y 10 dias post-inoculacion. Se analizaron mas de 20 lineas por cada construccion y los resultados mostraron que cada transgen introducido tuvo algun efecto de proteccion contra el virus. De esta manera, se obtuvo evidencia de la resistencia inducida por los genes correspondientes a la capside, la antisecuencia y la polimerasa de RBDV, los cuales dieron diferentes grados de proteccion. La construccion pJAD-10 (secuencia de la capside de la cepa de RBDV R-15) genero el mas alto nivel de proteccion entre las construcciones analizadas y algunas lineas de Nicotiana benthamiana transformadas con esta construccion mostraron inhibicion o retardo en la aparicion de sintomas de la infeccion con RBDV. Por otra parte, el resultado de la infeccion de lineas transgenicas transformadas con una secuencia no traducible de la capside o con la anti-secuencia de esta, sugiere que la resistencia puede ser generada o mediante la expresion de la proteina o por medio de transcriptos de RNAm para esta proteina. Estas construcciones estan ahora disponibles para ser introducidas en frambuesa.
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Plant tissue culture and regeneration
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FuenteDOAJ (DOAJ: Directory of Open Access Journals)