La tripanosomiasis americana es una enfermedad antropozoonotica causada por Trypanosoma cruzi, parasito flagelado que se anida y se reproduce principalmente en el tejido cardiaco. Se encuentra ampliamente distribuida en el continente americano y en Colombia se estima que un 2% al 3% de la poblacion esta infectado y que cerca del 5% esta bajo riesgo de adquirir la infeccion, debido a la amplia distribucion de los insectos triatominos, sus vectores. El presente estudio reporta la seroprevalencia para T. cruzi en perros (Canis familiaris) de dos areas rurales endemicas del departamento de Boyaca usando la tecnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la caracterizacion molecular de las cepas aisladas. Se procesaron 261 muestras de sueros de perros de diferentes edades obtenidas en los municipios de Soata y Berbeo. La deteccion de anticuerpos anti-T. cruzi se realizo mediante la tecnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Se realizo xenodiagnostico a 185 perros con cuatro resultados positivos, de los que se aislaron tres cepas, caracterizadas molecularmente como T. cruzi 1 (TC-I) por medio de la amplificacion del gene miniexon. Los analisis estadisticos mostraron asociaciones significativas entre caracteristicas de las viviendas tales como el tipo de pared, techo, piso y presencia de anexos con el numero de perros positivos para T. cruzi. Un total de 10,72% de los sueros procesados fueron positivos, 11,29% en Soata y 9,5% en Berbeo. Este primer trabajo sobre prevalencia de perros infectados con T. cruzi en Colombia revela la importancia epidemiologica de estos animales como reservorios y la caracterizacion molecular de los aislados contribuye al entendimiento de la dinamica de transmision del parasito.