Abstract: We have identified a novel DNA sequence of 500 bp (β500-DNA) on the Leishmania ( Viannia ) subgenus, located in the intergenic region of one of the loci of the β-tubulin gene family. The sequence analysis showed that this sequence has no homology to any other sequence described so far, including the β-tubulin gene. We improved a specific β500-PCR assay, which generated a PCR product of 375bp for total genomic DNA from Leishmania strains belonging to the L. ( Viannia ) subgenus. In contrast, no amplification was found when using genomic DNA from species of L. ( Leishmania ) subgenus or other organisms. Under our PCR conditions, the lower detection limit was 1 fg when a purified DNA clone (pLgβ4), which contains one copy of the β500-DNA sequence, was used. The β500-DNA PCR assay confirmed the preliminary diagnosis of cutaneous leishmaniasis in clinical samples in which the Montenegro skin test was positive and parasite cultures were negative. The analytical specificity and the sensitivity of the PCR assay provide a tool for epidemiological studies ofthe disease. Un ensayo de PCR para identificar especies de Leishmania del subgenero Viannia Resumen: En este trabajo identificamos una nueva secuencia de DNA de 500 pb (β500-DNA) en Leishmania del subgenero Leishmania ( Viannia ), localizada en la region intergenica de uno de los loci de la familia de los genes de la β tubulina. El analisis de secuencia mostro que β500 no tiene homologia con ninguna otra secuencia previamente descrita, incluido el gen de la β tubulina. Nosotros implementamos un ensayo de PCR especifico para β500, β500-PCR, que genera un producto de PCR de 375 pb a partir del DNA genomico de cepas de Leishmania pertenecientes al subgenero L. ( Viannia ). No hubo amplificacion alguna cuando se utilizo el DNA genomico de especies del subgenero L. ( Leishmania ) o el de otros organismos. En las condiciones establecidas, utilizando DNA purificado del clon pLgβ4, que contiene una copia de la secuencia de DNA de β500, el limite de deteccion mas bajo fue de 1 fentogramo. El ensayo β500-PCR confirmo el diagnostico preliminar de leishmaniasis cutanea en muestras clinicas de pacientes positivas a la prueba de Montenegro y negativas en el cultivo de parasitos. La especificidad y sensibilidad analitica del ensayo de PCR proporciona una herramienta para estudios epidemiologicos de la enfermedad.