A biohidrogenação ruminal de ácidos graxos insaturados da dieta tem um efeito im-portante na qualidade composicional final da carne e do leite de ruminantes. Assim, diversas abordagens metodológicas têm sido desenvolvidas para compreender e mo-dular esse processo bioquímico que ocorre no rúmen. Portanto, no presente capítulo, é apresentado um protocolo para realizar um ensaio in vitro para entender a biohidro-genação de ácidos graxos poliinsaturados no rúmen. O protocolo permite avaliar os efeitos de diferentes relações entre os ácidos linoleico e alfa-linolênico em suplemen-tos sobre a produção de intermediários de ácidos graxos derivados da biohidrogena-ção desses ácidos graxos insaturados no rúmen, usando uma abordagem in vitro. Nes-te protocolo, propõem-se os passos experimentais para simular a escala laboratorial, o processo de fermentação ruminal e, assim, a biohidrogenação de ácidos graxos insa-turados, os quais são posteriormente separados, identificados e quantificados usando cromatografia gasosa acoplada a detector de ionização em chama (GC-FID).