Em animais ruminantes, os ácidos graxos voláteis (AGVs) ou ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) são derivados da fermentação de proteínas e carboidratos pelo microrganismo ruminal. Assim, a determinação de AGV no líquido ruminal permite avaliar a qualidade nutricional de uma dieta, bem como seu potencial impacto na composição química do leite e da carne de ruminantes. Desta forma, no presente capítulo, apresenta-se um protocolo para extrair, identificar e quantificar os principais AGVs no líquido ruminal, utilizando a técnica de cromatografia líquida em fase reversa acopla-da a detector de arranjo de diodos (RP-HPLC-DAD). O método envolve a extração líquido-líquido de AGVs em líquido ruminal usando ácido fosfórico 0,85% m/m, cujo extrato é analisado por RP-HPLC-DAD após microfiltração. Os AGVs são quantificados pelo método de padrão externo.