Objetivo: Aislar e identificar los fitoesteroles mayoritarios presentes en la especie vegetal Ipomoea trífida a través de diversas técnicas cromatográficas, técnicas espectroscópicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas (EM). Metodología: Las partes aéreas de Ipomoea trifida fueron colectadas en la vereda La Concha, municipio de Circasia, Colombia. Luego, se secaron, pulverizaron y maceraron con hexano para el fraccionamiento y purificación de dos esteroles mayoritarios por cromatografía de columna. Las estructuras se elucidaron por técnicas de RMN y espectrometría de masas. Resultados: Los espectros de RMN-1 H, RMN-13C y DEPT 135, COSY, HSQC y espectrometría de masas mostraron señales características de los fitoesteroles, acetato de β-sitosterilo y el dihidrolanosterol, siendo el primer reporte para esta especie vegetal. Conclusión: Se aislaron e identificaron por primera vez dos fitoesteroles mayoritarios, el acetato de β-sitosterilo y el dihidrolanosterol en el extracto hexánico de la especie vegetal Ipomoea trifida colectada en el departamento del Quindío, como sólidos amorfos, mediante técnicas espectroscópicas que permitieron determinar la presencia del núcleo pentanoperhidrofenantreno, los grupos acetato e hidroxilo en la posición 3 para cada uno de ellos y la cadena lateral en la posición 17.