Los ecosistemas de agua dulce son una fuente primaria de servicios ecosistémicos esenciales para sustentar la vida y albergan una importante diversidad de especies acuáticas. El conocimiento sobre los macroinvertebrados acuáticos es precario en áreas declaradas como protegidas de Colombia. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la diversidad de macroinvertebrados acuáticos bioindicadores y la calidad ecológica de hábitat del Parque Nacional Natural Selva de Florencia (PNNSF). Se recolectaron muestras de macroinvertebrados en seis microcuencas, cuatro ubicadas dentro del Parque y dos en la zona de amortiguamiento. Se realizaron análisis de diversidad de orden Q, variación en la composición de especies, y su relación con las variables fisicoquímicas. Para estimar la calidad del hábitat y del agua se aplicaron los siguientes índices: Índice de Integridad del Hábitat (IIH), Índice de Calidad del Ecosistema Ribereño (QBR), y el BMWP. Se recolectaron un total de 2894 macroinvertebrados acuáticos. Los órdenes más representativos fueron Ephemeroptera y Trichoptera. Los resultados del IIH fueron de moderada a alta integridad. El QBR fluctuó entre 65-100, indicando un nivel de calidad intermedia, buena y muy buena. El BMWP indicó que todos los afluentes estudiados se encuentran en la categoría de aguas muy limpias sin evidencias de contaminación. Finalmente, se concluye que el PNNSF y su zona de amortiguamiento están cumpliendo su función en la conservación de la diversidad acuática y se destaca la importancia de continuar con las estrategias de monitoreo implementadas en el PNNSF, a fin de asegurar el mantenimiento de su diversidad biológica e integridad ambiental.