La leche materna humana es un alimento integral para los infantes en los primeros meses de vida y por diferentes factores como la morbimortalidad de la madre, que afecta la lactancia, se recurre a los Bancos de Leche. Este fluído biológico contiene una microbiota con propiedades probióticas, que ayuda al metabolismo de los nutrientes y la maduración del sistema inmunológico principalmente, beneficios que se ven reflejados en la salud del humano hasta la adultez. Se planteó caracterizar la microbiota de la leche humana de donantes y las heces de sus lactantes, provenientes del Banco de leche del Hospital General de Medellín y de mujeres residentes en Antioquia, recolectando un total de 134 muestras. Por identificación morfológica bioquímica o análisis molecular, se encontraron microorganismos con propiedades probióticas principalmente, Lactiplantibacillus plantarum y Enterococcus faecium, y de alterantes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y las levaduras. Se comprobó que la leche materna contiene una microbiota nativa que incluye microorganismos comensales y otros con propiedades probióticas, que la presencia de estos últimos se disminuye después de la pasteurización y es necesario implementar pruebas adicionales para la identificación de Bacterias Ácido Lácticas y evitar un descarte innecesario de la leche.