Introducción. La tuberculosis continúa siendo un problema de salud pública agravado por la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a los fármacos. Más del 95% de cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina (RIF) poseen mutaciones en una región del gen rpoB. Xpert® MTB/RIF es un sistema de biología molecular que, mediante 5 sondas (A, B, C, D, E) que conforman las secuencias del gen rpoB, permite identificar mutaciones en la región determinante de resistencia a la RIF de este gen. Objetivo. Describir la distribución y frecuencia de potenciales mutaciones asociadas con la resistencia a RIF en el gen rpoB de M. tuberculosis detectadas en muestras pulmonares y extrapulmonares usando el método Xpert® MTB/RIF. Materiales y métodos. Estudio retrospectivo. Se analizaron 66 muestras positivas para M. tuberculosis resistente a RIF procesadas por el sistema GeneXpert MTB/RIF entre enero de 2011 y julio de 2019 en un hospital universitario de Medellín, Colombia. De acuerdo con el software Dx System del instrumento GenXpert, se determinó que había una potencial mutación y resistencia a RIF, si la sondas no se unían a su secuencia complementaria natural o si se presentaba un atraso en la unión (delta CT >4) en relación con las otras sondas por presencia de una secuencia anormal. Los datos se analizaron mediante estadística descriptiva. Resultados. De las 66 muestras (48 pulmonares y 18 extrapulmonares), el 63.64% eran de hombres y la edad media de los participantes fue 39.60 ± 17.69 años. La frecuencia y distribución de mutaciones fue la siguiente: sonda E: 38 mutaciones (57.58%); B: 16 (24.24%), D: 8 (12.12%); A: 3 (4.54%) y D&E: 1 (1.52%). No se detectó ninguna mutación en la sonda C. Conclusiones. Las mutaciones asociadas a la resistencia a RIF en el gen rpoB de M. tuberculosis detectadas por el método Xpert® MTB/RIF se encontraron principalmente en la sonda E (codones 529–533). Por el contrario, en la sonda C no se no se detectó ninguna mutación.