En el departamento del Tolima no hay estudios que permitan precisar con certeza la magnitud del accidente ofídico causado por Crotalus durissus, existiendo la necesidad de generar información sobre el perfil proteico, como forma de aproximación a la compresión de algunas actividades biológicas relacionadas con la toxicidad del veneno, así como su potencial biotecnológico. En este trabajo se analizó el perfil electroforético por SDS-PAGE del veneno crudo extraído de individuos colectados en el municipio de Natagaima (Tolima) y la asociación con actividades fosfolipasa, hemolítica directa e indirecta y bactericida sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomona aeuroginosa. El veneno crudo presentó bandas de peso molecular 26.6 kDa., 17, 14.2, 6.5, 3.5 y 1.06 kDa., correspondientes con otros reportes previos del veneno para la especie. Se presentaron niveles considerables de actividades hemolítica (200 µg) y fosfolipasa (1.25 UA/mg. ± 0.88) dependientes de Calcio, y el efecto bactericida del veneno crudo fue diferencial sobre los microorganismos evaluados, presentando actividad moderada sobre Escherichia coli. Los resultados constituyen datos valiosos que confieren un acercamiento hacia el conocimiento del potencial tóxico del veneno de Crotalus durissus (cascabel) de la zonade Natagaima-Tolima, así como de la capacidad bactericida y posibles aplicaciones futuras en campos de investigación relacionados con la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos.