Introducción: Si bien la higiene de las manos es la medida más importante en la mitigación del riesgo biológico en ambientes hospitalarios, evidencia científica muestra un escaso cumplimiento de las recomendaciones entre los trabajadores asistenciales. Objetivo: Evaluar el cumplimiento de cinco dimensiones que fortalecen la estrategia de higiene de las manos para la prevención del riesgo biológico en ambientes asistenciales. Método: Estudio observacional, de corte transversal, en cinco instituciones prestadoras de servicios de salud. Se aplicó estadística descriptiva. Con el Test de Medianas se evaluó si había diferencias significativas entre el grupo de profesionales por institución de salud, considerando significante una p ≤ 0,05. El análisis finalizó con un análisis discriminante. Resultados: La representatividad estuvo en las instituciones hospitalarias de primer nivel en las cuales el personal de enfermería, seguido por los médicos, tuvo un mejor cumplimiento del protocolo de lavado de manos. Este porcentaje se vio impactado por el menor cumplimiento de suministro de insumos e infraestructura. Hay una perfecta diferenciación entre los resultados del municipio de Cali con relación al de Caicedonia, en contraste con los de Popayán, Buga y Buenaventura. Conclusión: Se encontró un incumplimiento del protocolo de higiene de las manos, con una calificación inaceptable para los factores de insumos/infraestructura y técnica de higiene de las manos, respectivamente.