La medición del cortisol total en sangre ha sido parte fundamental en el estudio del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal y de sus alteraciones, tales como el síndrome de Cushing y la insuficiencia adrenal. El cortisol circula en plasma en su mayoría unido a proteínas, pero su fracción libre es la biológicamente activa y se puede medir en sangre, orina y saliva. La secreción de cortisol no es homogénea durante el día, por el contrario, está regida por un ritmo circadiano, que a su vez, se puede ver afectado por diferentes estresores físicos y psicológicos. Por esta razón, se cuenta con pruebas como el cortisol en orina de 24 horas que permite evaluar la producción diaria de cortisol. También es posible realizar pruebas funcionales como la supresión de cortisol con dexametasona para el estudio del síndrome de Cushing y la prueba de estímulo con la hormona adrenocorticotropa (ACTH) como parte del estudio de la insuficiencia adrenal. Esta revisión tiene como objetivo realizar una puesta al día sobre los diferentes métodos para medir el cortisol como parte del estudio del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, haciendo énfasis en su utilidad para el diagnóstico de condiciones patológicas endocrinas.