La lactosa ha sido un azúcar de limitada aplicabilidad en la industria de alimentos debido a su bajo nivel de dulzura, baja solubilidad y deficiente digestión en la mayoría de la población global. Sin embargo, un alto volumen de producción de este disacárido podría obtenerse de la producción mundial de lactosuero y ser hidrolizado enzimáticamente para generar azúcares más dulces, muy solubles en agua y fácilmente digeribles como la glucosa y galactosa. Este estudio se propuso optimizar el proceso de hidrólisis de una enzima comercial (β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis) en un concentrado de lactosa (207 g L-1), obtenido por nanofiltración de lactosuero dulce. Un diseño de superficie de respuesta Box-Behnken permitió evaluar la influencia de diferentes factores sobre el porcentaje de hidrólisis, indicando que es posible obtener hasta el 84.5% mediante las siguientes condiciones de proceso: pH (6.11); temperatura (37.20 ºC); concentración de enzima (1.36 g L-1) y tiempo (176 min). El hidrolizado obtenido fue analizado; encontrándose minerales como potasio: 0.3 g 100g-1, magnesio: 0.020 g 100g-1, calcio: 0.060 g 100 g-1, fósforo: 0.09 g 100g-1), glucosa: 89 g L-1, galactosa: 66 g L-1 y coordenadas CIELAB: L = 32.3, a = -0.5 y b = 15.