La "leche humana", constituye el mejor alimento que puede darse en forma exclusiva al recién nacido generando el vínculo físico-biológico más importante entre la madre y la cría tras el parto. En este trabajo se planteó un estudio de tipo observacional, descriptivo y retrospectivo transversal sobre las propiedades fisicoquímicas y calidad microbiológica de la leche humana suministrada por 68 madres lactantes en edades de entre 15 a 39 años, de dos estratos socioeconómicos colombianos asociados al departamento del Tolima, considerando tipos de leche calostro, transición y madura, en relación a los parámetros de calidad establecidos en los programas de bancos de leche humana, además del contenido de cloruros, fenoles, fósforo y el perfil de electroforesis para proteínas. Los resultados de las propiedades fisicoquímicas de las muestras presentan variabilidad según el tipo de leche, difiriendo en algunos casos entre los promedios observados en los parámetros por estrato social. El análisis microbiológico descarta cargas excesivas de enterobacterias lactosa positivas en términos de NMP, mostrando valores aptos para el consumo de los lactantes. La técnica de electroforesis revela la presencia de lactoalbúmina, inmunoglobulina, caseína, albumina y lactoferrina, no siempre reportados en este tipo de trabajos. La investigación realizada se consolida como guía e iniciativa para el desarrollo de trabajos similares en otras zonas del país y con ello el fortalecimiento de programas mundiales de lactancia materna.