El Bosque Seco Tropical (bs-T) es uno de los ecosistemas más degradados de Colombia requiriendo acciones urgentes para la conservación de sus relictos remanentes y la restauración de áreas degradadas. La diversidad genética es una herramienta fundamental para identificar áreas prioritarias de conservación in situ, y evaluar la calidad de las poblaciones como fuentes de semilla para su uso en la restauración. Aquí se presentan los resultados de una caracterización genética realizada con marcadores moleculares ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) en 251 individuos de cuatro especies clave del bs-T Colombiano: Bursera simaruba, Platymiscium pinnatum, Hura crepitans y Caesalpinia ebano. Las poblaciones más diversas para las cuatro especies se encontraron en la región del Caribe y en el enclave del Cañón del Chicamocha. Platymiscium pinnatum y B. simaruba también mostraron valores altos de diversidad en el valle del río Cauca y el desierto de La Tatacoa, respectivamente. Además, se evidenció estructura genética en las cuatro especies que podría estar asociada a las transformaciones históricas del bs-T en los periodos geológicos del Pleistoceno y el Holoceno. Finalmente, se identificaron fuentes de semilla en cada región para cada especie y entre ellos se destacan el norte Caribe y el área del enclave del Cañón del Chicamocha, por su riqueza y particularidad genética.