Los análisis de ADN antiguo (ADNa) han incrementado en los últimos años permitiendo conocer la diversidad genética de las poblaciones precolombinas. En Colombia, existen pocos registros arqueológicos de la población prehispánica del Norte de Santander habitada en el siglo XVI por el grupo Chitarero. Por este motivo, nos propusimos analizar la diversidad genética a partir de secuencias de la región HVRI del ADNmt y determinar sus posibles relaciones con otras comunidades tanto antiguas como contemporáneas. Se analizaron siete individuos precolombinos asociados a este grupo prehispánico, recuperados en los municipios de Cácota y Silos en el departamento de Norte de Santander de los Andes Orientales colombianos, siguiendo criterios estrictos de autenticidad para el ADNa. En todos los individuos se logró identificar el haplogrupo B caracterizado por el polimorfismo en la posición 16217C, siendo éste uno de los más frecuentes en comunidades precolombinas y contemporáneas de los Andes Suramericanos. Este hallazgo indica que este grupo poblacional se encuentra estrechamente emparentado por línea materna, con posibles índices de endogamia, con una probable densidad demográfica baja y una baja diversidad genética, similares a lo observado en comunidades pertenecientes a periodos anteriores como el Formativo. Este grupo precolombino exhibe una de las diversidades genéticas más bajas reportadas en las poblaciones pertenecientes a la familia lingüistica Chibcha. Estos resultados genéticos coinciden con los planteamientos sobre el grupo Chitarero de pertenecer a comunidades pequeñas independientes, con asentamientos dispersos, apartados unos de otros.