La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad maligna, sistémica, de alta morbilidad (70 %) y baja mortalidad, ocasionada por la infección con el virus de la leucosis bovina (BLV). La LBE afecta principalmente los bovinos de leche, disminuyendo la producción de leche de 2.5 a 5 % respecto al hato; además, causa inmunosupresión, permitiendo que otros patógenos afecten la producción y reproducción de los animales. El objetivo fue determinar la presencia o ausencia del BLV a través de dos metodologías de diagnóstico: una técnica serológica (ELISA) y una técnica molecular (PCR). Se tomaron 1,000 muestras de sangre de vacas Holstein distribuidas en 10 municipios lecheros del Departamento de Antioquia. Se realizó una PCR para obtener un producto de PCR de 444 pb correspondiente a una región altamente conservada del gen env viral, que codifica para la proteína de envoltura gp51. Se realizó un ELISA indirecta contra la proteína gp51 para estos mismos animales. La PCR detectó un número menor de muestras positivas (474) que la prueba ELISA (546). La sensibilidad de la PCR fue de 74.91 % y su especificidad fue de 85.68 % respecto al ELISA. El grado de concordancia entre pruebas fue moderado (kappa=0.59). El municipio con la mayor prevalencia molecular fue Rionegro (73.91 %), mientras que la mayor seroprevalencia se registró en el municipio de El Retiro (85.19 %). El BLV ha aumentado su presencia en la región; la detección de este patógeno no solo permitirá determinar la prevalencia, sino también usar los datos obtenidos en programas de prevención y control de la enfermedad.