El objetivo de la investigación fue determinar la prevalencia de mastitis bovina y la resistencia antimicrobiana de los patógenos involucrados en una región lechera de Colombia. Los cuartos mamarios de 348 vacas fueron examinados y evaluados mediante la prueba de California para el diagnóstico de mastitis (CMT). Las muestras positivas a CMT se cultivaron para el aislamiento bacteriológico y susceptibilidad a antibióticos mediante el método de difusión en disco. El análisis de los resultados se realizó mediante estadística descriptiva y relación de prevalencia. Los resultados indican que 158 (45.4%) de las vacas fueron positivas para CMT. Se encontró mastitis clínica en siete vacas (2.0%) y mastitis subclínica en 151 vacas (43.4%). El grupo estafilococo coagulasa-negativo (SNC) fue el principal patógeno encontrado en el 46.7% de los aislamientos, seguido de Staphylococcus aureus (31.1%) y Streptococcus spp (20.7%). Klebsiella pneumoniae y E. coli tuvieron una baja ocurrencia (0.5%). CNS, Staphylococcus aureus y Streptococcus spp presentaron un alto grado de resistencia a penicilina G y a eritromicina, además de multirresistencia.