En este artículo se presentan los resultados del desarrollo y validación de una metodologíaanalítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglode diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de cafeína; se utilizó una columnaC18 con detección UV a 273 nm y una fase móvil compuesta por agua/acetonitrilo(80:20 v/v) de modo isocrático. Las características de desempeño evaluadas permitieroncomprobar que existe una adecuada selectividad, una linealidad entre 0,5 y 50ug/mL, con una precisión expresada como RSD menor a 2%, un porcentaje de recuperacióndel 99,9% y unos límites de detección y cuantificación para el método de2,99 y 2,69 ng/mL, respectivamente. El método propuesto es útil para determinar elperfil de permeación bucal de la cafeína mediante un estudio in vitro con celdas deFranz empleando membrana bucal porcina.