Introducción: La fasciolosis representa un grave problema para el sector pecuario y la salud humana en muchos países.En Colombia, afecta principalmente al ganado bovino y ovino, con escasos reportes en humanos.Objetivo: Estandarizar un Ensayo de Inmunoadsorción Enzimática para bovinos, ovinos y humanos como herramienta de tamizaje de fasciolosis.Metodología: Se utilizaron 50 muestras de bovinos, 50 de ovinos y 39 de humanos con diagnóstico de fasciolosis confirmado por serología y examen de materia fecal.Se utilizaron cuatro presentaciones del antígeno excretor-secretor de Fasciola hepatica.Se calcularon la sensibilidad, la especificidad y la concordancia.Resultados: La sensibilidad del ELISA en humanos, ovinos y bovinos fue de 100% y la especificidad fue de 97%, 85,2% y 96,2%, respectivamente.El coeficiente Kappa de Cohen fue superior a 0,8 en las tres especies.Conclusiones: La prueba de ELISA estandarizada para el diagnóstico de la fasciolosis humana, ovina y bovina demostró una excelente sensibilidad y buena especificidad.Se propone realizar la validación a mayor escala para su posterior uso como herramienta en el tamizaje de esta parasitosis.