Introdução: A temática higienização das mãos tem sido prioridade nas instituições de saúde, com vistas a contemplar aspectos da segurança do paciente. Objetivo: Identificar o conhecimento das equipes de enfermagem atuantes em unidades de internação clínica, médica e cirúrgica, sobre a higienização das mãos. Materiais e Métodos: Trata-se de um estudo transversal, quantitativo, desenvolvido em um hospital privado de porte III, do Estado do Rio Grande do Sul, no ano de 2015. Resultados: Participaram do estudo 92 profissionais, totalizando 82% da população-alvo. Evidenciou-se que a preparação alcoólica estava disponível para 100% dos entrevistados, além do desconhecimento do tempo adequado de fricção para destruir os micro-organismos das mãos, reconhecimento de que recebiam treinamento e de que conheciam os cinco momentos da higiene das mãos. Discussão e Conclusões: Identificou-se, em relação às ações que evitam a infecção do profissional da saúde, a higienização das mãos imediatamente após o contato com o paciente e com fluidos corporais. Torna-se fundamental a necessidade de promover educação permanente referente a esta prática no controle de infecções em serviços de saúde e incentivar a higienização das mãos dentro dessa instituição, a qual, contribui para a segurança do paciente e do profissional.