El objetivo del presente trabajo fue el aislamiento de las diferentes bacterias causantes de mastitis, haciendo énfasis en la diferenciación de las especies de Mycoplasmas , de las muestras de leche de tanque y de vacas individuales, procedentes de fincas lecheras del Altiplano Boyacense. Mediante un muestreo probabilístico de conveniencia y por medio de un estudio descriptivo longitudinal retrospectivo, entre 2010 y 2012, se estudiaron 30 fincas, especializadas en la producción de leche, con promedios de 50 animales en lactancia, por finca. Streptococcus agalactiae , se aisló en el 9,1% y se convirtió en el principal patógeno aislado. Staphylococcus aureus fue aislado, en promedio, en el 6,6%. Mycoplasma bovis , no se encontró en ninguna muestra, a través de los tres años. M. californicum , se recuperó a partir de 14 muestras, en los tres años (1,5%); M. alcalescens , de 31 muestras (3%), en los tres años y Acholeplasma spp., se aisló de 19 muestras (1,4%). Este trabajo es el primer reporte de aislamiento de Mycoplasma spp., a partir de muestras de leche en Colombia, en el Altiplano Boyacense.