El propósito de este estudio fue detectar serológica (prueba de microaglutinación) y molecularmente (el ADN de Leptospira spp. por PCR convencional-reacción de la polimerasa en cadena) la exposición o presencia de Leptospira spp., a partir de muestras de suero sanguíneo, líquido preseminal y semen en caballos reproductores criollos colombianos representativos de esta raza, en 44 criaderos del departamento de Cundinamarca. En Colombia no existen estudios relacionados con la presencia de leptospiras en semen equino, y dentro de los planes sanitarios en esta especie no se vacuna contra esta enfermedad. Se evaluaron muestras de un total de 107 animales, escogidos por muestreo por conveniencia, de las cuales al analizar el suero fueron seroreactivas 35 (32,7 %), correspondientes al serogrupo Leptospira interrogans, serovariedades Canícola, Pomona y Grippotyphosa. Se detectó el DNA de Leptospira spp., por PCR convencional en dos muestras de semen que representaron el 1,9 % del total de muestras. Mediante la técnica de campo oscuro se encontraron en la mayoría de las muestras de líquido preseminal diferentes formas bacterianas, algunas de ellas compatibles con leptospira. También se observaron células de descamación, cristales y uratos. Adicionalmente, no se obtuvo aislamiento de la bacteria en el medio EMJH y no se detectó ADN mediante la técnica de PCR convencional a partir del líquido preseminal.