Se evaluó la colonización in vitro y la actividad enzimática extracelular (xilanolítica y celulolítica) de los hongos ruminales Neocallimastix frontalis H10001 y Orpinomyces intercalaris H20013 sobre hojas de las gramíneas Brachiaria decumbens y Pennisetum clandestinum. Para promover la colonización y actividad enzimática se utilizaron tres niveles de sulfato de sodio (0%, 4% y 12% p/v). La colonización se evaluó determinan­do el número de esporangios·mm–2 y la actividad enzimática se evaluó en el sobre­nadante a las 72 h por cuantificación de los azúcares reductores liberados durante el proceso. El número de esporangios varió (P < 0,05) con la interacción tipo de gramínea × nivel de azufre. Para N. frontalis la adición de S incrementó el número de esporangios excepto para N. frontalis sobre B. decumbens (P < 0,05); mientras que para O. intercalaris la adición de S incrementó el número de esporangios en ambas gramí­neas (P < 0,05). El mayor número de esporangios se obtuvo con O. intercalaris sobre P. clandestinum en las concentraciones de 4 y 12% de S (12,77 y 14,82 esporangios·mm–2, respectivamente). La actividad xilanolítica extracelular varío (P < 0,05) con el tipo de gramínea; la mayor actividad xilanolítica extracelular se determinó en el sobrenadan­te de O. intercalaris sobre B. decumbens. La actividad celulolítica extracelular varió (P < 0,05) con la interacción tipo de gramínea × nivel de azufre. La utilización de 4% de S incrementó (P < 0,05) la actividad celulolítica extracelular de los sobrenadantes de N. frontalis y O. intercalaris en ambas gramíneas; mientras que la adición de 12% de S no afectó (P > 0,05) la actividad celulolítica de N. frontalis sobre P. clandestinum y de O. intercalaris sobre B. decumbens en comparación con el control; no obstante, la actividad celulolítica extracelular en los sobrenadantes de N. frontalis sobre B. decumbens y de O. intercalaris sobre P. clandestinum se redujeron (P < 0,05). Los resultados de este estudio indican que el número de esporangios y la actividad celulolítica extracelular de cul­tivos puros de los hongos N. frontalis y O. intercalaris dependen del tipo de gramínea y del nivel de S presente en el medio de cultivo; así mismo, la presencia de S mejora el crecimiento y desarrollo de los hongos.