El uso indiscriminado de fertilizantes químicos y su proceso de obtención y aplicación ha incrementado los costos de producción agrícola y los problemas ambientales debido a la contaminación del aire, el suelo y las aguas. Se ha planteado como alternativa la aplicación de fertilizantes biológicos como una herramienta económica y limpia para el manejo sostenible de los ecosistemas. Sin embargo, en los procesos de escalamiento de un biofertilizante pueden incrementarse los costos de producción debido al tipo de formulación y a los medios de cultivo empleados para la multiplicación de las bacterias. Esta investigación, con base en el uso secuencial de diseños estadísticos, presenta la estandarización de un medio de cultivo económico para la multiplicación de la cepa C50 de Rhizobium sp. De ocho fuentes nutricionales se seleccionaron cinco, teniendo como criterios los menores costos económicos y la disponibilidad de dichas fuentes; de estas cinco, tres influyeron significativamente sobre el desarrollo de la cepa. La composición optimizada del medio alterno incluyó glicerol, melaza, glutamato, extracto de levadura y sales. No se presentaron diferencias significativas en el crecimiento de la cepa C50 en el medio alterno comparado con el tradicional (levadura-manitol), ni en la viabilidad de la cepa crecida en el medio tradicional respecto al alterno, cuando se inoculó sobre turba. El inoculante conservó su calidad en refrigeración durante 30 días. Las cepas J01, T14 y C2 mostraron buen índice de crecimiento sobre el medio alterno; no se presentaron diferencias significativas en los recuentos entre las cepas J01 y T14, mientras que la cepa C2 creció mejor en el medio alterno.