Los antibióticos son utilizados en la criopreservación de semen equino con el fin de controlar la proliferación de microorganismos; sin embargo, estos pueden tener efectos negativos sobre los espermatozoides. La presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto de dos preparaciones antibióticas sobre el desarrollo microbiano y la calidad de semen equino criopreservado. El semen de 10 caballos criollos colombianos fue criopreservado por congelación convencional, con dos preparaciones antibióticas: P1 (penicilina 10000 UI/ml y estreptomicina 10 mg/ml) y P2 (penicilina 10000 UI/ml, estreptomicina 10 mg/ml y anfotericina B 25 µg/ml) y un grupo control sin antibióticos. Posterior a la descongelación, se realizó la evaluación computarizada de la movilidad espermática, la prueba hipoosmótica (HOS) y el conteo de bacterias y hongos en el semen. El análisis estadístico se realizó mediante modelos lineales generalizados (GLM) y la comparación de medias por Tukey. Se encontró diferencia significativa (p<0.05) para movilidad total (MT%) entre P1 (32.2 ± 17.6) y P2 (34.4 ± 19.1) con el grupo control (39.7 ± 16.5) y para movilidad progresiva (MP%) entre P1 (15.5 ± 14.8) con P2 (17.9 ± 16.5) y el control (19.6 ± 14.1). Para la proliferación microbiana se encontró diferencia significativa (p<0.05) para bacterias (UFC/ml) entre P1 (167.7 ± 237.1) y P2 (240.1 ± 321.0) con el grupo control (464.4 ± 448.5). El uso de preparaciones antibióticas con penicilina, estreptomicina y anfotericina B en la criopreservación de semen equino reduce la proliferación de bacterias, pero produce una disminución en la movilidad espermática posdescongelación.<br /><br />