En Colombia, la gallina Criolla es socialmente importante por su aporte nutricional, fácil reproducción, adaptabilidad y rusticidad. Por lo tanto, ha sido necesario conocer cómo es su diversidad, relaciones y estructura genética. El objetivo de este estudio fue ccontribuir al conocimiento de la biodiversidad del país y al desarrollo agropecuario sostenible, mediante el estudio de la diversidad genética de aves criollas. Se analizaron 224 muestras de ADN de gallina Criolla colombiana provenientes de los departamentos del Cauca, Caldas, Chocó, Nariño y Valle del Cauca, y 20 de líneas comerciales, mediante 17 marcadores microsatélites, realizándoles extracción de ADN por el método de Salting Out y posteriormente amplificando por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis estadístico para evaluar la diversidad genética se realizó a través de los programas ARLEQUIN v. 3.5, GENALEX v. 6.5, Microsatellite Toolkit y FSTAT. La estructura de las poblaciones se determinó por el programa STRUCTURE v. 2.3.4. Se encontraron 79 alelos para las poblaciones. El número promedio de alelos para la gallina Criolla fue de 4,65±1,66. La heterocigosidad esperada fue mayor que la observada y varió de 0,59 en Chocó a 0,62 en el Valle del Cauca. El FIS fue de 0,40 (p