El virus de la leucosis bovina (BLV) posee un genoma RNA de cadena sencilla, pertenece a la familia Retroviridae y presenta ocho genotipos diferentes. Los linfocitos B son la célula blanco del BLV, lo cual tiene un impacto negativo sobre el sistema inmune de los bovinos ya que los hace más susceptibles a otras enfermedades de origen infeccioso además las vacas lecheras presentan una menor producción respecto al hato (2,5 a 5 %). Esta enfermedad se transmite a través del consumo de leche y principalmente de forma iatrogénica. El objetivo del presente trabajo fue diagnosticar BLV por medio de la técnica PCR anidada, para lo cual se tomaron 500 muestras de sangre de vacas Holstein pertenecientes a varios hatos ubicados en los principales municipios con carácter lechero en el departamento de Antioquía, durante los meses de febrero a junio de 2013. Se realizó una PCR anidada para detectar el provirus amplificando una región del gen env viral. Se obtuvo un fragmento de 444 pb y se comprobó la identidad de la secuencia a través de la aplicación BLAST ®. La prevalencia para el departamento de Antioquía fue del 44 % (219/500). Uno de los productos de PCR fue secuenciado y clasificado como genotipo 1; se encontró un 99 % de identidad con la secuencia FJ808575.1. Se evaluaron tres subregiones lecheras Oriente, Norte y Valle de Aburra. La presencia del virus fue de 70 %, 45 %, 31 % respectivamente. La prevalencia molecular de BLV varió entre 16 y 88 % por municipio. Se encontró diferencia estadísticamente significativa (p