<p>El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de cuatro métodos de separación seminal sobre la calidad y la capacidad fertilizante <em>in vitro</em> de espermatozoides equinos criopreservados. Se utilizaron pajillas de semen equino criopreservado para la separación espermática a través de los métodos Androcoll, CushionFluid, EquiPure y Percoll. Mediante un sistema analizador de clase (SCA®) se evaluó la motilidad total, motilidad progresiva, velocidad curvilínea, velocidad lineal y velocidad media, y por microscopía de fluorescencia se determinaron los acrosomas intactos y la vitalidad espermática. La evaluación de la capacidad fertilizante <em>in vitro </em>se realizó mediante la fertilización <em>in vitro</em> de oocitos bovinos con espermatozoides obtenidos en cada método de separación. El clivaje se determinó después de tres días de cultivo <em>in vitro</em>. Los resultados se analizaron mediante modelos lineales generalizados (GLM) y las medias para los diferentes métodos se compararon usando la prueba de Tukey. El CushionFluid fue superior para la mayoría de parámetros de movilidad espermática, así como para acrosomas intactos (p<0.05). Se encontraron medias superiores de vitalidad espermática para EquiPure y Percoll (p<0.05), pero no se encontró diferencia entre las medias de clivaje entre tratamientos. Se concluye que el semen equino criopreservado y seleccionado por el método CushionFluid presenta mejores parámetros de calidad espermática respecto a los otros tres métodos; sin embargo, no se evidencia diferencia entre ellos para la capacidad fertilizante <em>in vitro</em> de los espermatozoides.</p>