Lutzomyia longipalpis, es el principal vector de leishmaniasis visceral en el Neotropico y su identificación taxonómica es relevante en el contexto de la epidemiología y control de la enfermedad. La evidencia de un complejo de especies morfológicamente indistinguibles y la similitud morfológica de las hembras con otras especies del subgénero Lutzomyia y con la serie longipalpis, dificultan la identificación taxonómica cuando no se dispone de machos. En el presente estudio usamos la secuencia propuesta a nivel mundial como código de barras genético para diferenciar especies animales, para caracterizar especímenes pertenecientes a L. longipalpis de tres localidades de Colombia y evaluar su utilidad para separarlos de especies cercanas como L. gomezi, L. cruciata y L. bifoliata. El fragmento amplificado y secuenciado exhibió una longitud de 548 pb encontrándose 26 haplotipos para 33 individuos de L. longipalpis, un haplotipo para L. gomezi, un haplotipo para L. cruciata y dos haplotipos para L. bifoliata. Las distancias genéticas (K2P) entre haplotipos de L. longipalpis (0,05-0,07) y las agrupaciones en un dendrograma de NJ, separaron adecuadamente los individuos de L. longipalpis de los individuos de especies cercanas. Los individuos de L. longipalpis se separaron en dos grupos, uno que relaciona los haplotipos de Neiva y El Callejón, y otro para Girón. Las distancias genéticas entre los dos grupos de L. longipalpis fueron superiores a las registradas a nivel intraespecífico para especies previamente estudiadas con base en la secuencia código de barras como L. trinidadensis (0,042) y L. panamensis (0,02).