Introducción La dificultad en la identificación morfológica de las hembras de varias especies del subgénero Nyssorhynchus ha sido documentada y se debe a la similitud morfológica interespecie, variación intraespecífica y la existencia de especies crípticas. Por ello, se han utilizado pruebas moleculares como la PCR-RFLP-ITS2, que permiten confirmar la identidad de las especies presentes en regiones endémicas. obJetivo Confirmar la identificación de mosquitos del género Anopheles recolectados en Juan José, Puerto Libertador, Córdoba, como aporte a un inventario de especies en la localidad. Materiales y métodos De 2.070 hembras de Anopheles identificados por caracteres morfológicos, 513 (24,8%) se confirmaron molecularmente mediante una PCR-RFLP-ITS2. Resultados Las especies identificadas por morfología presentes en Juan José fueron: Anopheles (Nyssorhynchus) nuneztovari s.l. Gabaldon (97,44%), Anopheles (Nys.) darlingi Root (0,77%) y Anopheles (Nys.) oswaldoi s.l. Peryassu (0,10%); el resto de especímenes (1,69%) se definieron como pertenecientes a una de las especies del grupo Oswaldoi. La confirmación molecular permitió determinar la presencia de sólo dos especies entre los especímenes analizados, 99,23% A. (Nys.) nuneztovari s.l. y 0,77% A. (Nys.) darlingi. Conclusión Las dos especies de Anopheles encontradas en Juan José, durante el muestreo, son consideradas vectores primarios en Colombia; esta información es importante para dirigir los esfuerzos de control vectorial. Adicionalmente, los resultados reiteran previos reportes sobre la dificultad en la identificación morfológica de A. nuneztovari s.l. y la importancia de utilizar pruebas moleculares en su confirmación de especie.