Introducción. La infección de transmisión sexual causada por Chlamydia trachomatis es la más frecuente de etiología bacteriana en el mundo. Aunque puede ser asintomática en la mayoría de los casos, C. trachomatis puede generar diversos problemas de salud reproductiva en mujeres, como cervicitis, endometritis y salpingitis. A pesar de su importancia, en Medellín no se cuenta con suficientes datos epidemiológicos sobre esta infección.Objetivo. Determinar la prevalencia de C. trachomatis en mujeres de Medellín, determinar los posibles factores de riesgo y evaluar la relación con la infección por el virus de papiloma humano (HPV).Materiales y métodos. Se hizo un estudio transversal multicéntrico para detectar la infección por C. trachomatis en 1.282 mujeres mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y el estuche comercial LightMix 480 HT CT/NG™ (Roche, Basilea, Suiza).Resultados. La prevalencia total de la infección por C. trachomatis fue de 4,1 % (IC95% 2,9-5,3). Se encontró una relación significativa de la infección con la edad, el consumo de cigarrillo y el uso de anticonceptivos hormonales.Conclusión. La prevalencia de la infección es similar a la reportada en otros lugares del país y del mundo, siendo las mujeres más jóvenes las más afectadas. En cuanto a la presentación del HPV, no se encontró ningún tipo de relación con C. trachomatis.