Objetivo: Validar y aplicar una escala de conocimientos y prácticas en higienización de las manos en estudiantes de odontología. Metodología: Estudio longitudinal de validación y aplicación de una escala e intervención educativa en una población de 39 estudiantes de Odontología. Se empleó una fuente de información primaria que consiste en una escala de conocimientos y prácticas; la fiabilidad se evaluó con el coeficiente de alfa de Cronbach; la consistencia interna y la validez discriminante con coeficientes de correlación de Pearson y la validez de contenido y constructo mediante el análisis factorial exploratorio de componentes principales. La efectividad de la intervención educativa respecto a los conocimientos y prácticas se evalúo con un análisis bivariado. Resultados: El porcentaje de éxito en la consistencia interna fue de 77,2 % para los ítems de conocimientos y 72,7 % para los de prácticas; la validez discriminante fue del 100 % para ambos dominios; para la validez de contenido y constructo, el porcentaje de éxito fue del 100 %; en la fiabilidad se obtuvieron alfa de Cronbach iguales a 0,7. Los puntajes en los dominios de conocimientos y prácticas fueron significativamente mejores después de la intervención educativa. Conclusiones: Se halló una excelente confiabilidad y validez en la escala construida, lo que representa la disponibilidad de un instrumento para la evaluación de los conocimientos y prácticas en higienización de las manos en profesionales de la salud y la orientación de procesos de información, comunicación y educación.