Se efectuó un estudio de corte sobre la prevalencia de mastitis bovina en una muestra representativa de las granjas lecheras del altiplano norte de Antioquia, Colombia. Se evaluaron los resultados del California Mastitis Test (CMT), Recuento de Células Somáticas (RCS) y cultivo bacteriológico de leche, y se analizaron los factores de riesgo asociados a mastitis bovina. El análisis estadístico de la información se efectuó por medio de estadística descriptiva, análisis de razón de prevalencias y regresión logística multinivel. Con la prueba de CMT se detectó un 20% de cuartos afectados con mastitis, la prevalencia de mastitis subclínica por vaca fue del 39,5% y la de mastitis clínica fue del 1,7%. Se efectuaron 648 cultivos de muestras de leche, de las cuales 23,9% fueron negativas, 34% positivas a Streptococcus agalactiae y 10,2% a Estafilococo coagulasa negativo. El análisis de regresión reveló que las vacas que tuvieron más de seis meses de lactancia presentaron una Odds Ratio (OR) de 2,65 en comparación con las de un mes de lactancia (p < 0,05). Se halló un OR de 1,24 para la asociación de la edad y la mastitis (p < 0,05). Para el lavado de manos se encontró un OR de 0,36 en comparación con no hacerlo (p < 0,05). En conclusión, se halló una alta frecuencia de mastitis por vaca. El microorganismo más hallado fue el Streptococcus agalactiae. El trauma podría ser una causa importante de mastitis dado que no se observó crecimiento bacteriano en 23,9% de los cultivos de muestras de leche de cuartos con mastitis.